利用拉曼光谱鉴别现存和已灭绝大象象牙

如今，大象象牙贸易是一个全球性问题，导致了世界范围内大象数量的减少。虽然近年来许多国家都出台了限制象牙贸易的法律法规，同时还禁止了象牙贸易，但对于古董或具有文化意义的物品，通常是被允许的。随着“猛犸象猎人”的兴起，猛犸象牙贸易也在不断增加，这些人在西伯利亚北极地区进行探险，以获取猛犸象牙作为经济收益。

近年来，由于全球气温升高导致永久冻土解冻，在夏季的几个月里几乎可以看到保存完好的猛犸象标本，因此这种活动变得更加容易。这种合法的象牙来源给全球的边境保护和海关团队带来了执法问题，因为这两种不同类型的象牙制品在视觉上很难区分。

象牙是由牙骨质、牙釉质和牙本质层形成的矿化结缔组织，髓髓腔占据了象牙的近端。牙本质是象牙的主要组织。牙本质的微观结构包括从牙髓腔辐射到牙本质的牙本质小管。牙本质由牙本质细胞形成，牙本质细胞在铺设基质时向中心移动，并排列在髓腔内；这些细胞产生 I型和IV型胶原蛋白，这些胶原蛋白随后被以磷酸钙为基础的牙本质磷灰石晶体矿化。

在长牙的切片上，可以看到由深色和浅色线条组成的棋盘图案从中心向外围辐射。这种“施雷格图案”被认为，与牙本质细胞在牙石形成过程中沉积牙本质时路径的微小移动有关。牙骨质是环绕在近端尖牙周围的一层，主要功能是将尖牙根部与上颌骨连接起来。

骨水泥由骨水泥母细胞形成，是一种比牙本质更软的材料，水/胶原蛋白与矿物质的比例更高（50:50，而牙本质为5:95）。釉质由釉母细胞形成，是哺乳动物体内最坚硬的组织，几乎完全由碳酸盐矿物组成。牙髓是由神经、血管和牙本质细胞组成的结缔组织。

象牙源自长鼻目动物的象牙（上门牙）。大象和猛犸象的象牙结构大致相似。不过，在显微镜下，牙管的密度有所不同。猛犸象牙中的齿管比现代大象的齿管更紧密地排列在一起，这可能与行为上的差异有关，猛犸象牙承受着更大的负荷，如更多的打斗或举重。大象和猛犸象牙的施雷格图案也不相同。

长鼻目包括有躯干和象牙的哺乳动物，如现存的非洲草原象、非洲森林象和亚洲象，以及包括长毛猛犸象在内的许多已灭绝物种。大象和猛犸象最初长出的獠牙是脱落的，长度只有5 厘米。这些象牙会在一年后脱落，而永久性象牙会在大象的一生中继续生长。最初，恒牙的牙本质外围覆盖着一层薄薄的骨水泥和珐琅质。随着时间的推移，这些骨水泥和珐琅质层会因使用而磨损。

雄性和雌性非洲象和猛犸象都有象牙，而雌性亚洲象没有象牙（或有小“象牙”）。非洲象的象牙存在性别差异；雄性象牙较大，周长和长度终生都在增加，而雌性象牙较小，成熟后周长不再增加。此外，青春期过后，雌性象牙的牙髓腔开始被骨水泥填满，而雄性象牙的牙髓腔则随着年龄的增长而增大。

在猛犸象身上也发现了类似的差异。雌雄大象的獠牙都用于进食和争夺霸主地位。众所周知，大象的獠牙占优势；优势侧的象牙通常比非优势侧的短，因为它在更多的使用中会磨损。

象牙制品历来在世界各地都很受欢迎。全球野生动物基金会对消费者行为进行了研究，从文化和实际角度找出象牙贸易仍然存在的原因。研究表明，购买者最有可能是生活在中国小城市的中高收入妇女。 这些人购买象牙的原因有很多，主要是由于在遥远的东方，象牙因其稀有性和价值被视为身份的象征，且象牙被视为一种安全投资，类似于购买艺术品。象牙还常用于传统药物、珠宝、装饰品、小型雕刻和塑像，历史上还曾用于制作钢琴键和台球等物品。虽然大象象牙的使用因保护和保存的加强而有所减少，但西伯利亚永久冻土的开发和“猛犸象猎人”的有组织努力使猛犸象象牙市场蓬勃发展。

2017年，Palkopolou等人绘制了已灭绝大象和在世大象的基因组数据。尽管据估计，长鼻目至少有200个不同的物种，其中约40个是大象，但目前该科在世的成员仅有两种非洲象。据2016年非洲象数据库调查估计，非洲现存大象总数为41万头，比2013年的上一份报告减少了约9万头。虽然由于非法偷猎导致亚洲象减少的百分比较低，因为雌象没有象牙，但亚洲象在过去三代中减少了50%。

 

图1：本项目中包括的象牙样本。(A)非洲象属样本（8个手镯），右下角是亚洲象单个样本；(B)猛犸象样本

联合国毒品和犯罪问题办公室建议使用多种实验室技术来评估象牙贸易的合法性。这些技术包括施莱格尔线分析法、傅立叶变换红外光谱法、DNA和mtDNA分析法、同位素分析法和拉曼光谱法，但建议主要侧重于DNA/mtDNA和同位素分析法的使用。

 

图2：猛犸象、非洲象和亚洲象象牙样品的平均拉曼光谱。(A)每个象牙样品的平均光谱，猛犸象（洋红色）、非洲象（青色）和亚洲象（黄色）；(B)猛犸象（洋红色三角形）、非洲象（青色正方形）和亚洲象（黄色圆圈）的PCA分数图；(C)载荷图显示PC1和PC2的差异

区分大象和猛犸象牙的主要非破坏性方法是根据施雷格纹的不同。施雷格纹可分为外施雷格纹和内施雷格纹，这取决于它们是出现在象牙的表面还是髓部。外施莱格尔纹由于角度不同，可以用来区分大象象牙和猛犸象牙。在大象象牙中，施雷格纹线的平均交角为115°，并形成特有的“V”形。在猛犸象牙中，施雷格纹的角度更大，形成“U”形，交角小于90°。不过，内施莱格尔线在鉴定象牙种类时并不实用。

目前，业界已出版了一个凸线和凹线的施雷格纹数据库，用于识别大象和猛犸象牙之间的差异。然而，这种鉴定方法需要垂直于象牙轴线的完美横切面。此外，另一种已灭绝的长鼻类动物乳齿象的象牙，也呈现出与大象类似的钝施雷格角。

这就造成了保存完好的乳齿象象牙被误认为是大象象牙的可能性。最终，施雷格纹分析只能区分大象和猛犸象象牙，还需要其他方法对大象的种类和亚种进行更精细的鉴定。如果很难确定象牙样本的方向，可以寻求DNA鉴定或放射性碳年代测定法，但这些研究成本高、耗时长，且具有破坏性。

傅立叶变换红外光谱和拉曼光谱，都是通过红外吸收或拉曼散射来检测分子振动。直到十年前，由于样品降解和荧光等问题，拉曼光谱的应用还不如傅立叶变换红外光谱广泛，尽管现代技术已经解决了其中的许多问题。现代拉曼光谱使用相对简单，对生物样本无损伤。这种技术在骨骼健康分析中的应用有据可查，空间偏移拉曼光谱已被用于提供组织表面区域以下标本生物化学的详细信息。这项技术不具有破坏性，可在体外、体内或体外使用。

拉曼光谱是一种测量和量化光（使用激光）从材料散射时能量变化的方法。当光（光子）与分子键相互作用，为分子键振动提供能量时就会损失或获得能量，从而导致波长的变化。输出数据包含光的不同变化信息，被称为拉曼“指纹”或“光谱”。生化成分，如钙化组织样本中的有机成分和矿物成分，可以通过对出现的峰值进行解释和分析来确定；进一步的多元分析，如主成分分析和线性判别分析，可用于阐明整个光谱范围内的变化。例如，胶原蛋白与磷酸盐的比率越高，样品的弹性就越大。非洲森林象象牙的内部结构复杂，胶原纤维呈明显的“十字交叉”状，使象牙具有更高的强度和耐久性，这种“硬度”是日本象牙市场的首选。

在中国，人们对非洲象牙和大叶象牙的“较软”象牙没有什么偏好。这些品种的象牙更脆，更容易碎裂，这可能是由于胶原蛋白与磷酸盐的比例低于非洲森林象羊角象牙。大象象牙的颜色也有明显差异。热带草原象的象牙呈奶油色，而森林象的象牙则被描述为粉红色。这种 “粉色象牙”在日本非常珍贵，经常被用来制作印章，当地人称之为“hanko”或“inkan”。

拉曼光谱以前曾被用来分析象牙标本，以评估样本的生物退化情况、大象的年龄以及区分真假象牙。空间偏移拉曼光谱已被用于识别隐藏在涂层下面以避免被发现的象牙。由于该技术是非破坏性的，不需要进行任何样品制备，因此有可能在世界各地的海关用于鉴定猛犸象和大象象牙，以帮助执行象牙贸易禁令。

本文假设，由于猛犸象和大象象牙的生化成分不同，因此可以使用拉曼光谱来区分这两种象牙。将通过测量象牙矿化度和胶原蛋白成分的差异来验证这一假设。

 

方法
◆ 标本
猛犸象和大象的象牙样本，由英国伦敦自然历史博物馆友情出借。所有猛犸象牙（图1B）都来自猛犸象这一物种，样本来自利亚霍夫群岛和叶尼塞河附近的克拉斯诺亚尔斯克（俄罗斯西伯利亚），属于晚更新世时期。大象象牙样本（图1A）包括一个大象象牙的横截面和八个象牙雕刻手镯，这些样本由自然历史博物馆的工作人员根据地理来源和外观进行鉴定。这些样品都没有经过处理或涂层。

◆ 拉曼光谱
使用配备奥林巴斯50×/0.5长工作距离物镜和785nm激光的inVia显微拉曼光谱仪（雷尼绍）采集每个象牙样品的光谱。样品上的激光功率约为10mW。在600-1700cm-1的光谱范围内，每个光谱收集60秒（6×10秒累积）。每个样品至少在10个不同的位置采集独立光谱，每个位置相距10μm以上，以提供重复光谱并考虑任何异质性。

在一个猛犸象样本上，使用从髓质到皮质的线图采集了更多光谱，并且避免了从有明显碎片或损坏的象牙区域采集光谱。最终，从8个原始猛犸象样本中获得了272个光谱，从非洲象获得了203个光谱，从亚洲象获得了17个光谱。

◆ 数据分析
数据分析采用Matlab使用六阶多项式减法对所有光谱进行基线校正，并使用之前发布的脚本对矢量进行归一化处理。对这些数据进行主成分分析，每次分析最多生成10个主成分。为便于分析，数据按种和/或属进行了分类。使用Excel对磷酸盐（960cm-1）与酰胺I（1660cm-1）峰以及磷酸盐（960cm-1）与酰胺III（1240-1260cm-1）峰强度比进行了单变量分析，以比较大象和猛犸象牙样品的矿物质与胶原蛋白比率。

 

图3：(A)象牙样本，猛犸象（洋红色）和活象（蓝色）的PCA分数图；(B)每个象牙样本非洲象（青色和蓝色）和亚洲象（黄色）的PCA图；(C)与(B)相对应的PCA负载图

这些峰值被选为每个样本光谱中一致存在的重要峰值。此外，碳酸盐（1060cm-1）与磷酸盐（960cm-1）的峰强度比也用于研究碳酸盐的替代情况。使用GraphPad Prism对每个峰强度比进行单因素方差分析。使用SpectraGryph计算了磷酸盐峰（960cm-1）的半最大全宽（FWHM），以比较晶体的成熟度。在分析线图数据时，将光谱分为14个类别（每个类别代表约0.5厘米的行程），并进行PCA线性判别分析（PCA-LDA）。

◆ 研究结果
每个样品的平均光谱显示，样品的生化成分大致相似（图2A）。猛犸象牙的光谱质量表明，猛犸象牙保存完好，因为有突出的有机胶原蛋白峰。结果显示了不同种类哺乳动物象牙光谱 “指纹”的异同。PCA分数图（图2B）显示了不同物种的明显分组，但样本间存在一些差异。

图2A展示了本研究分析的11个样本中每个样本的平均光谱，并按物种进行了分类。所有样品都显示出保存完好的有机成分，并有明显的酰胺峰。PCA分数图（图2B）显示了物种之间的一些差异，以及物种内部的一些差异；最大的差异是来自非洲象和猛犸象的象牙化学成分。图2C是一个PCA负载图，表明差异最大的是磷酸盐峰（960cm-1）、酰胺III峰（1240-1260cm-1）和酰胺I峰（1650cm-1）。

数据显示了猛犸象象牙和大象象牙之间的一些区别，相应的PCA负载图显示了PC1在磷酸盐（961cm-1）、脂质（1300cm-1）和酰胺I左侧（1590cm-1）区域的差异、 而PC2的显著贡献则来自磷酸盐峰（960cm-1）、酰胺I峰中部（1665cm-1）、酰胺III峰（1250和1270cm-1）、碳酸盐峰（1070cm-1）和 CH2峰（1250cm-1）（图3C）。这意味着，从PC1的差异中可以确定，所有三个物种之间最强烈的差异是由特定有机成分和紧靠羟基磷灰石峰中心右侧的波长造成的。由于磷酸盐峰中心、碳酸盐峰和几个胶原蛋白峰的贡献，猛犸象沿PC2进一步分离（图 3C）。

通过分析磷酸盐峰与酰胺1（图4A）或酰胺III（图4B）峰之间的比率，可以区分不同种类的象牙（图4A-4C）。对酰胺I、酰胺III和碳酸盐峰与羟基磷灰石峰之间的峰强度比（图4A-4C）进行单因素方差分析，结果表明象科所有三个成员的平均值在计算的每个比值上都有显著的统计学差异（p<0.0001）。具体来说，象牙样本中胶原蛋白（酰胺I和酰胺III）与磷酸盐的比率更高（图4A和4B）。

 

讨论

本研究的结果表明，拉曼光谱在鉴定来源不明的象牙样品方面具有明显的实用性。本研究表明，使用PCA可以识别不同物种之间平均光谱的差异，对磷酸到酰胺I和酰胺III峰的单变量分析可用于区分象牙属的不同物种，碳酸盐到磷酸峰的比较也是如此。大象的矿物质与胶原蛋白比率较高，这可能反映了其在进化过程中与猛犸象物种的分化程度比与羚牛物种的分化程度更近。

 

图4：(A)取自猛犸象、非洲象和亚洲象的象牙样品中磷酸盐（960cm-1）与酰胺I（1660cm-1）峰值强度比的单变量分析。误差条显示的是平均值的1个标准差。进行了普通的单因素方差分析，F=19.99，平均值之间存在显著差异（P<0.0001），R2=0.07559。(B)取自猛犸象、非洲象和亚洲象的象牙样品中磷酸盐（960cm-1）与酰胺III（1240-1260cm-1）的峰值强度比。误差条表示平均值的1个标准差。进行了普通的单因素方差分析，F=59.52，平均值之间存在显著差异（P<0.0001），R2=0.1958。(C)取自猛犸象、非洲象和亚洲象的象牙样品的碳酸盐（1060cm-1）与磷酸盐（960cm-1）的峰强度比。柱形表示与平均值的1个标准偏差。进行了普通的单因素方差分析，F=126.2，平均值之间差异显著（P<0.0001），R2=0.3404。(D)计算了磷酸盐峰值（960cm-1）的半最大值全宽（FWHM），以比较晶体的成熟度

这项研究还表明，拉曼光谱也可用于鉴别象牙样本是来自象牙的髓质还是皮质。此外，分析还突出了物种之间和物种内部不同的主要光谱特征，这些特征主要与矿化剖面有关。这一点可以通过更大的样本量来进一步探索，特别是因为不同物种之间骨骼矿化度的差异已被广泛报道，据推测，牙齿也可能因结构、物种内的功能和环境的不同而表现出差异。

在长毛象物种中出现的样本间差异可能是由于样本的年龄、长毛象死亡时的年龄、饮食或气候条件的差异，也可能是由于长毛象所处的地质条件略有不同，这可能会对象牙的微观结构产生影响，从而影响随后的材料特性，例如永久冻土保存的象牙硬度低于新鲜材料。还有证据表明，骨骼样本在埋葬后会发生变化，骨骼和周围物质之间会交换微量元素。这种现象很可能也发生在被掩埋的象牙样本中。

此外，在这项研究中，猛犸象样本先前经过研磨和抛光，这意味着反射的光子数量增加，信噪比提高。然而，许多猛犸象样本表面粗糙，没有经过抛光处理，这意味着它们的信噪比较低，这可能是原始猛犸象样本光谱差异较大的部分原因。

初步研究表明，通过比较样本中胶原蛋白与生物磷灰石的峰值比，可以判断出大象獠牙的生物年龄。人类研究获得的数据也表明，拉曼光谱可用于了解哺乳动物钙化组织的年代。不过，迄今为止，利用拉曼光谱测定象牙年代的研究还很有限。

作者推测，可以通过拉曼光谱以两种方式之一观察到基于日期的差异：一种是通过胶原蛋白到矿物的降解率随时间的推移而变化，另一种是通过识别象牙表面涂层或已融入象牙基质中的替代物质（一种用于确定历史艺术品年代的方法）。开发对象牙样本进行年代测定的非破坏性技术，有助于区分古董和新制作的象牙工艺品，并为在全球范围内检测非法象牙提供了另一种有力的工具。

这项研究的一个重要局限是只分析了少量象牙样本。这意味着分析获得的信息量有限。这项工作还需要探索非洲草原象象牙和非洲森林象象牙在生物化学方面的差异。据了解，非洲森林象象牙比非洲草原象象牙更直，其象牙被描述为更硬且呈粉红色。

在牙本质的形成过程中，晶体结构中可能会有许多离子被取代，这可能包括阴离子，也可能包括阳离子。这些替代物可能是造成非洲森林象象牙“带粉红色”的原因，这种生化成分上的差异，可以用来在光谱学上区分非洲草原象和非洲森林象。未来的工作，旨在进一步了解这些现存大象之间象牙化学结构的差异，并在进行光谱分析的同时对象牙进行遗传分析，以确保准确的物种鉴定。

这里发现的一些“种间”差异，尤其是8个猛犸象样本之间的差异，有可能部分甚至主要是由于性别或年龄的差异，或随着时间的推移，胶原蛋白发生了变化。要评估物种内部和物种之间的差异水平，还需要进行更大规模的样本研究，在采集光谱之前使用光化学漂白法可以减少背景荧光。不过，尽管存在样本量的限制，,数据分析的主要模式似乎反映了种间差异。

本研究使用PCA和PCA-LDA作为多元分析技术，但在拉曼光谱数据集分析中还使用了其他方法，如多元线性回归、聚类分析和偏最小二乘法回归。未来对这些方法进行比较，可能有助于确保正确的物种分类。

总之，拉曼光谱是一种很有前途的象牙鉴定工具。虽然这项研究使用的是大型实验室内拉曼光谱仪，但最近的一项研究表明，小巧便携的移动式拉曼光谱仪也能提供类似的质量数据。手持式拉曼光谱仪已在骨组织研究中使用多年，在工业中也经常用于原材料验证和未知物质鉴定。

需要进一步开展工作，评估种内和种间变异，并编制可用于识别未知象牙样品的参考光谱功能数据库。每个物种的平均光谱特征可以添加到濒危野生动植物种国际贸易公约贸易数据库，或联合国毒品和犯罪问题办公室象牙鉴定指南中，供全球各地海关快速查询。这可以形成一种快速简便的方法来确定象牙种类，帮助打击非法贸易。利用拉曼光谱加强对全球海关过往样品的监督和监测，可以对偷猎濒危和极度濒危大象物种的人起到威慑作用。

 

作者：Rebecca F. Shepherd（英国布里斯托尔大学）、Adrian M. Lister（英国伦敦自然历史博物馆）等

 

来源：荣格-《国际工业激光商情》

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