液相色谱法测定硝化纤维素中苯系物含量的研究

硝化纤维素，也称纤维素硝酸酯。干燥的硝化纤维素极易燃烧，通常加入乙醇、异丙醇作为减敏剂（润湿剂）再进行包装、贮存、运输。硝化纤维素广泛应用于涂料、油墨等领域，用于油墨领域的硝化纤维素通常作为凹印油墨中的树脂成分，在油墨中起分散介质的作用，它使颜料和填充料均匀地分散于其中，并在它们周围形成保护，不让其发生沉淀现象，使油墨有良好的印刷转移性能，用硝化纤维素配制的油墨，结膜光滑、硬度高。20世纪80年代后凹版印刷以其印刷品色彩鲜艳、品质高得到广泛的认同，软包装行业（食品包装、香烟包装等）有 95%以上的产品采用凹版印刷，且绝大部分凹印油墨仍含有苯、甲苯等对人体有害的有机化合物[3]。随着世界经济朝着继续深化及可持续发展战略的转变，环境保护和食品安全浪潮的冲击，消费者对商品的包装提出了越来越高的要求，绿色包装是国际环保发展趋势所需。与此相适应，塑料软包装的绿色化也成了发展的必然趋势，这就对其重要组成部分凹印油墨的组分及油墨自身的环保性提出了更高的要求。硝化纤维素作为凹印油墨中的主要成分之一，油墨用户要求不得有苯检出，而甲苯、乙苯含量不得超过20ppm。

苯系物的常规测定方法为气相色谱法，它具有快速简便、样品用量少、灵敏度高、精确度好等特点，但是一般的气相色谱法对苯系物的检测精度最高为40mg/L，无法满足检测的精度需求。苯系物的另外一种检测手段为液相色谱法，它是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各组分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农业、商检等科学领域中重要的分离分析技术。

针对硝化纤维素中苯系物的残留限量的要求，以及对测试的精度和稳定性要求较高的特点，选取液相色谱法对硝化纤维素及其润湿剂中苯系物进行分析研究，通过对仪器的调试和分析条件的摸索，建立有效的硝化纤维素中苯系物的分析方法。

试验

◆主要仪器与试剂

主要仪器

美国 Waters公司液相色谱仪，带紫外检测器和色谱数据处理工作站；C18色谱柱；超声波清洗器；高速离心机；分析天平，精度0.0001g。

试剂

甲醇，液相色谱级；乙腈，液相色谱级；苯，色谱级；甲苯，色谱级；乙苯，色谱级；间二甲苯，色谱级；邻二甲苯，色谱级；异丙醇，色谱级；试验用水为超纯水。

标准储备溶液：使用异丙醇作溶剂，使用分析天平分别准确称取约0.0080g的苯、甲苯、乙苯、二甲苯于50mL的容量瓶中，分别配制成约为160mg/L的苯系物标准储备溶液。

标准工作溶液：使用异丙醇作溶剂，准确移取适量的标准储备溶液于50mL的容量瓶中，分别配制成苯系物约为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的系列工作溶液。

◆试验步骤

色谱标准建立

将配制好的系列标准工作溶液注入液相色谱仪内，重复注射2~3次，采集不同浓度（不少于3个点）标准的色谱图，以保留时间对照定性，以理论浓度和标的物色谱峰面积相关联，建立色谱标准。

样品分析

试样溶液的制备：称取一定量的硝化纤维素样品（称准至0.0001g），放入洁净干燥的具塞三角瓶中，再量取一定量的异丙醇于该三角瓶中，摇匀后在超声波清洗机中处理一定时间，取出静置，将上清液倒入离心试管中，高速离心几分钟。

抽取清液经0.45um的滤膜过滤于2ml的样品瓶中，使用微量进样针抽取一定量样品注入液相色谱仪内，重复注射2~3次。将样品色谱图与标准谱图对照，以保留时间对照定性，以峰面积定量分析样品中苯系物含量。

结果与讨论

◆色谱条件选择

检测波长确定

分别取适当浓度的各苯系物标准溶液在分光光度仪上于 170~350nm波长下扫描，如图 1所示。

图1，苯、甲苯、乙苯的紫外吸收光谱图

由图 1图谱可见，苯在254nm有最大吸收；甲苯在261nm处有最大吸收；乙苯在260nm处有最大吸收。为保证苯物质的检出有较好的吸收，同时兼顾其余苯系物在测定时均在其最大吸收波长附近，综合考虑后选择256nm作为检测波长。

柱箱温度确定

柱箱温度会直接影响物质出峰的保留时间，液相色谱的柱箱温度普遍较低，柱温变化对标的物保留时间影响较小。为保证色谱峰的分离度和稳定的保留时间，同时兼顾夏季、冬季的较大温差，特选取35℃的色谱柱箱温度作为检测温度（图2）。

图2，不同柱箱温度的苯系物色谱图

流动相及比例确定

在液相色谱中，当固定相选定时，流动相的种类、配比对分离效果会产生很大影响，所选择的流动相不能和色谱柱的固定相互溶。为获得合适的溶剂极性，常采用二元或多元组合的溶剂体系作为流动相。在反相色谱中，通常以水为流动相主体，再加入不同配比的有机溶剂作调节剂，常用的有机溶剂是甲醇、乙腈、四氢呋喃等，一般情况下，甲醇-水体系已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但是，本试验对苯系物检测精度要求较高，对比了甲醇和乙腈作为流动相的基线噪声和分离度，乙腈作为流动有机相主体的基线噪声比甲醇好，苯系物的检测精度更高，但二甲苯与乙苯的分离度没有甲醇为流动相时好。经统计与研究，硝化纤维素还未出现过二甲苯超标的情况，因此，试验兼顾考虑苯、甲苯的检测精度，选用乙腈-水二元体系作为流动相（图3）。

图3，不同流动相的苯系物色谱图

液相色谱法中，流动相比例对各待测组分的分离起着决定性的作用，适当的流动相比例不仅能提高各组分的分离度，还能有效缩短分析所需时间，故需进行流动相比例的选择试验，采用同一根色谱柱，调节流动相乙腈和水的比例，以使各组分达到很好的分离度。

图4，不同流动相比例下的苯系物色谱图

从图 4可见，随着水在流动相中的比例加大，各物质的分离度会逐渐增大；保留时间增长，导致总的分析周期也会不断变长。综合考虑在较好的分离度下，分析周期不能太长，故最终选定的流动相比例为乙腈：水=50:50。

流速的确定

色谱柱的柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效，对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对于内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL/min。

进样量

确定本次试验液相色谱的进样方式是采用手动旋转六通阀式进样，带定量环，现实验室的定量环规格有5ul、20ul、200ul三种。本次试验在色谱柱长度确定的情况下，既要保证痕量检测标的物的响应值，又要保证柱容量不超载，峰型不拖尾，通过比对，因此本试验选用20ul的进样量。

◆苯系物的保留时间

在确定的色谱条件下，依次配制适当浓度的苯系物浓度，按溶剂、溶剂 +苯、溶剂+苯+甲苯、溶剂 +苯+甲苯+乙苯、溶剂 +苯+甲苯+乙苯+二甲苯的方式进样，确定四种苯系物的保留时间。（表1）

表1.苯系物的保留时间

◆苯系物的检出限

为测试苯系物的检测限，将苯系物分别配制成0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、10mg/L的浓度，分别进样分析，并测试其信噪比。（信噪比为3倍时的样品浓度即为仪器对该物质的检测限）。

表2.苯系物的检测限

由图5可见，苯系物含量在约0.3mg/L时，响应值很低，苯系物含量在约0.5mg/L时，苯、甲苯的信噪比能达到了检出限要求；苯系物含量提升到1 mg/L时，乙苯、二甲苯的信噪比能达到了检出限要求，因此，在该试验条件下，苯系物的检出限见表2。

图5，不同苯系物含量的色谱图

◆苯系物标准曲线

将不同浓度的苯系物标准工作溶液建立分析标准，建立的标准曲线如图6。

图6，苯系物的标准曲线

苯系物各组分的浓度与峰面积有很好的线性关系，相关系数R达到0.999的水平，其线性回归方程、线性范围、相关系数统计见表3。

表3.线性回归方程、线性范围及相关系数

◆稳定性及回收率试验

配制两个样品进行精密度试验，连续测试5次，结果见表4。

表4. 精密度试验结果（单位： mg/L）

精密度试验结果表明，苯、甲苯、乙苯的测试结果均方差均＜0.1，变异系数＜10，有较好的精密度。在样本中加入苯系物进行加标回收试验，连续平行测试3次，回收率结果见表5。

表5. 回收率试验结果

试验表明，该测试方法的苯、甲苯、乙苯的回收率在96%~101%之间，能满足实验室分析要求。

结论

这是一种高效液相色谱法检测硝化纤维素中苯系物的方法。该方法对苯系物的检测限为苯0.5mg/L、甲苯0.5mg/L、乙苯0.8mg/L，相比气相色谱仪，对苯系物的检出限更低，更易于对苯系物含量进行分析。使用本方法测定的苯系物浓度与峰面积有较好的线性关系，回归方程的相关系数能达到0.999，方法的精密度能满足检测要求。