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植物复合提取物的头皮护理功效研究

来源:国际个人护理品生产商情 发布时间:2021-01-16 1116
食品饮料及个护个人护理品原料配料加工生产设备包装设备及材料其他 功能性配料
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摘要:以蔓荆果﹑龙胆﹑何首乌根组成的植物复合提取物(VGP)为研究对象,通过多种方法对其应用于头皮护理上的抗炎止痒、控油去屑功效进行研究。结果显示,在糠秕马拉色菌诱导的角质形成细胞和单核细胞炎症模型上,VGP在质量分数为0.01%~0.125%的范围下能剂量依赖性地抑制白介素6 (IL-6)﹑前列腺素E2 (PGE-2)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白介素1β (IL-1β)的表达。招募17例具有各种不同症状头皮问题的受试者,每周2-3次使用含0.5% VGP的测试期洗发水进行测试,通过检测头皮油脂含量、经表皮水分流失(TEWL),专家评价或受试者主观评价头皮红肿程度、头屑程度,发现VGP可明显缓解头皮红肿、头屑、头痒问题,降低头皮油脂含量和TEWL值。因此,VGP作为一种天然来源的具有抗炎止痒功效的活性原料,可应用于头皮护理及皮肤护理领域。

随着生活水平的提高,头皮健康状况越来越受到重视。头皮作为人体皮肤最薄的部分之一,加之毛囊皮脂腺等皮肤附属器官的高密度分布,使得紫外线(UV)﹑污染物(PM2.5)等易对皮肤结构造成损伤,引发炎症[1,2]。皮肤炎症在临床上可表现为头屑﹑红斑﹑小疙瘩、灼热刺痛及最为常见的瘙痒[3-6]。引发头皮炎症的物质主要有两类,一是皮脂中的角鲨烯﹑甘油三酯﹑不饱和脂肪酸等暴露于外界环境中,可在过氧化物酶﹑脂氧合酶等的作用下,发生过氧化反应,产生角鲨烯过氧化物(SQOOH)﹑丙二醛(MDA)等[7,8];二是马拉色菌属如球形﹑糠秕马拉色菌(M.furfur)可通过分泌磷脂酶,将皮脂中的甘油三酯、饱和脂肪酸分解为促炎性的不饱和脂肪酸(包括油酸﹑亚油酸)等[9,10]。这些物质渗透入角质形成细胞﹑单核细胞﹑肥大细胞等产生细胞毒性,并激活下游信号途径,促进炎症因子如花生四烯酸(LTB-4)﹑白介素(IL)-1α﹑前列腺素E2(PGE-2)﹑IL-6﹑IL-8﹑肿瘤坏死因子(TNF)-α﹑IL-10等的表达,导致皮肤屏障功能改变,最终产生各种头皮问题[7-10]。


已有研究表明,很多种植物提取物均对马拉色菌的生长有抑制效果,同时兼有抗氧化的功效,但少有植物提取物抑制马拉色菌和脂质过氧化物诱导头皮炎症的研究。利用热灭活的M.furfur培养液刺激单核细胞,建立了一个高通量的炎症因子筛选模型。通过筛选30余种植物提取物及20余种按不同比例组合的植物复合提取物,发现由蔓荆(Vitextrifolia)果提取物﹑龙胆(Gentianascabra)提取物和何首乌(Polygonummultiflorum)根提取物组成的植物复合提取物(VGP)具有显著的抗炎作用。再于角质形成细胞炎症模型﹑单核细胞炎症模型、人体头皮临床测试模型上分别进行验证,来阐述VGP的抗炎止痒作用,为其在个人护理领域中的进一步开发和利用提供依据。


1实验部分


1.1主要试剂与仪器


VGP溶液,上海珈凯生物科技有限公司生产,由蔓荆(Vitextrifolia)果、龙胆(Gentianascabra)、何首乌(Polygonummultiflorum)根三种提取物依照特殊工艺复配而成,其中主要活性物木犀草素和白藜芦醇的含量经HPLC方法检测后分别为0.15%和0.1%。


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图1 VGP对M.furfur诱导的NHEK细胞炎症因子 的作用


糠秕马拉色菌(M.furfur,ATCC44344)﹑LeemingandNortman(LAN)培养基,北京中科质检生物技术有限公司;人角质形成细胞(NHEK,来源于ATCC)﹑人单核细胞(THP1,来源于ATCC),北纳创联(苏州)有限公司;DMEM培养基﹑RPMI1640培养基﹑胎牛血清(FBS)﹑青霉素-链霉素(PS),美国ThermoFisher公司;DPPH自由基粉末﹑噻唑蓝(MTT),美国Sigma公司;IL-6﹑PGE-2﹑单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)﹑IL-1β检测试剂盒﹑CCK-8溶液,欣博盛生物科技有限公司。


                                                                     表1 VGP对细胞活性的影响

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倒置显微镜及DC3000拍照软件,江南永新光学有限公司;生物安全柜(配备紫外灯)﹑MultiSkanFC酶标仪,美国ThermoFisher公司;SM815油脂测试探头,德国CK公司;VapoMeter皮肤水分散失测试探头,丹麦Delfin公司。


1.2实验方法


1.2.1炎症刺激物制备


M.furfur用LAN培养基在37℃需氧条件下培养48h,于酶标仪620nm处检测吸光度,根据标准曲线计算菌液终浓度后,再于85˚C热灭活30min,即为诱导细胞产生损伤及炎症的初始菌液[11]。此菌液的浓度为5×108~8×108CFU/mL,通过测试不同浓度菌液(用培养基稀释)处理下NHEK细胞和THP1细胞的细胞活性和不同炎症因子的表达量,确定最终的菌液浓度。


1.2.2NHEK细胞炎症因子表达量检测


参照文献[11-15],将含10%FBS﹑1%PS的DMEM培养基培养至指数增长期的NHEK细胞以2×104/孔接种于96孔板中培养24h,弃去培养液后再加入180μL用培养基稀释成不同质量分数的VGP溶液或甘草酸二钾溶液,同时设置DMEM培养基为阴性对照,加入或不加入20μL菌液(终浓度为0.75×108CFU/mL),于37˚C继续孵育24h。下层细胞用MTT法检测细胞活力[13],上层培养液收集至96孔板中,按照ELISA试剂盒的说明书分别检测IL-6和PGE-2的表达量(E),抑制率=(1-EVGP溶液/EM.furfur)×100%。


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1.2.3THP1细胞炎症因子表达量检测


参照文献[16,17],将含10%FBS﹑1%PS的RPMI1640培养基培养至指数增长期的THP1细胞以5×104/孔接种于96孔板中培养24h,不同质量分数的VGP溶液或甘草酸二钾溶液按之前所述方式处理细胞,再加入或不加入20μL菌液(终浓度为0.25×108CFU/mL),于37˚C继续孵育24h。下层细胞用CCK-8法检测细胞活力[16],上层培养液收集至96孔板中,按照ELISA试剂盒的说明书分别检测MCP-1﹑IL-1β和PGE-2的表达量(E),抑制率计算同前。


1.2.4人体头皮临床测试


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图2 VGP对M.furfur诱导的THP1细胞炎症因子的作用


招募17例头皮脂溢性皮炎受试者,其中头皮屑症状严重者5人,头皮红肿症状严重者8人,年龄25-60岁,其中男性5例,女性11例。入选标准包括:①受试者过去至少3个月内连续出现中度及以上程度的头皮瘙痒、头皮屑、头皮红肿等症状;②头发长度≥3cm,无严重脱发,发根生长覆盖至少70%头皮;③招募期和调理期结束头皮屑等级≥3级或红肿等级≥3;④身体健康、无疾病。


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图3 VGP对头皮油脂含量和TEWL的作用


测试期间温度为(22±1)℃,相对湿度为(50±5)%。前调理期2周使用不含VGP的调理期洗发水,测试期4周使用含0.5%VGP的测试期洗发水,每周洗3次,每次按摩头皮至少1分钟后冲洗干净。分别在前调理期、测试期定期追踪,记录受试者头屑程度、头皮红肿程度、头皮瘙痒程度和头皮出油程度,测试时间点计为T0w、T2w、T4w、T6w。将头皮分为12个区域,专家评价员在每个时间点选择头屑最严重的4个区域采用“ASFS评分标准”进行评估,选择红肿、出油最严重的4个区域采用0-5分的评分标准进行评估,受试者通过问卷调查的形式主观评价头皮瘙痒症状的改善情况。同时,采用VapoMeter检测TEWL值,SM815检测油脂含量,并采集照片进行对比分析[13,14]。


1.2.5数据分析


采用GraphPadPrism5软件对数据进行统计分析,采用配对t检验对数据进行显著性分析。P<0.05认定为差异显著,以“*”标记;P<0.01认定为差异极其显著,以“**”标记。


2结果与讨论


2.1VGP对细胞活性的影响


不同质量分数的VGP处理NHEK细胞和THP1细胞24h后,MTT法或CCK-8法检测细胞活性发现,0.25%的VGP使NHEK的细胞活性降为30.58%,使THP1的细胞活性降为29.21%,具有细胞毒性,而0.125%的VGP作用下,两种细胞的细胞活性均保持在80%以上,见表1。因此,后续选用质量分数为0.125%及其以下的VGP进行实验。


2.2VGP对NHEK细胞炎症因子的作用


脂质本身的过氧化反应及其被M.furfur利用,分解﹑氧化成不饱和脂肪酸,可刺激细胞分泌多种炎性介质和细胞因子,导致炎症及异常免疫状态的发生[9,15]。将M.furfur在含有油脂的培养基中培养48h后热灭活处理,得到的菌液作为一种混合性刺激物,同时采用H2O2溶液作为另一种过氧化物刺激物,分别诱导细胞炎症的发生。


                                                                                                                 表2 VGP对头皮红肿、头屑及瘙痒的作用

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首先研究M.furfur及VGP对表皮层角质形成细胞初始炎症的影响。M.furfur诱导的NHEK细胞炎症因子表达量的变化如图1a,b所示(M.f,灰色柱),IL-6的表达量从20.57ng/L升至36.77ng/L,PGE-2的表达量从945.85ng/L升至1228.35ng/L,说明M.furfur可诱导NHEK细胞产生炎症。同时检测VGP的抗炎效果,结果发现在质量分数为0.016%~0.125%(细胞活力达到80%以上)的范围内,IL-6和PGE-2的表达量呈现剂量依赖性的下降趋势,抑制率在0.125%时达到最大,且与同等浓度的甘草酸二钾相比(Ref,白色柱),显示出更好的抗炎效果。


2.3VGP对THP1细胞炎症因子的作用


再研究M.furfur及VGP对真皮层单核细胞炎症的影响[16,17]。M.furfur诱导的THP1细胞炎症因子表达量的变化如图2a,b,c所示(M.f,灰色柱),MCP-1﹑IL-1β﹑PGE-2的表达量分别从92.92,13.96,22.23ng/L上升至368.36,64.28,65.17ng/L,说明M.furfur也可诱导THP1细胞产生炎症。同时检测VGP的抗炎效果,结果发现在质量分数为0.016%~0.125%(细胞活力达到80%以上)的范围内,MCP-1﹑IL-1β和PGE-2的表达量也呈现剂量依赖性的下降趋势,抑制率也在0.125%时达到最大,且与同等浓度的甘草酸二钾相比(Ref,白色柱),仍然显示出更好的抗炎效果。


2.4VGP对各种头皮问题受试者的作用


通过以上研究,可说明M.furfur培养液对表皮层和真皮层细胞造成损伤,产生炎症。而IL-6﹑PGE-2﹑IL-8﹑LTB-4等炎症因子又可作用于皮肤C类神经纤维上的各类受体,传导痒觉﹑痛觉[18-21]。我们进一步研究VGP在人体头皮上的抗炎止痒功效。


招募17例头皮脂溢性皮炎受试者,经过调理期筛选,最终合格受试者16名,其中头皮屑症状严重者5人,头皮红肿症状严重者8人。首先通过仪器分析头皮油脂含量(图3.a)和TEWL(图3.b)的变化情况。调理期后(T2w)与调理期前(T0w)相比,油脂含量和TEWL值变化不明显,而经过4周的测试期(T4w、T6w)后,油脂含量从71.91µg/cm2降至43.54µg/cm2,减少了39.45%,具有显著性差异。TEWL也从18.6g/hm2降至16.14g/hm2,减少了13.23%,说明VGP可以减少头皮脂溢性头皮的油脂含量和TEWL,改善头皮微环境。


主观评价的结果如表2所示。调理期后(T2w)与调理期前(T0w)相比,头皮红肿、头屑、瘙痒评分均无明显改善含量,而经过4周的测试期(T4w、T6w)后,头皮红肿、头屑、瘙痒评分均呈现下降趋势,特别是含0.5%浓度的VGP测试期洗发水使用4周后,红肿、头屑、瘙痒评分分别从2.31、1.98、3.20降至0.75、0.47和1.75,从轻微到中度症状缓解至不明显症状。说明VGP可缓解脂溢性头皮的各种炎症反应,发挥抗炎止痒、去屑的功效。


3结论


1)VGP可显著降低M.furfur诱导的角质形成细胞IL-6﹑PGE-2炎症因子的表达量,单核细胞MCP-1﹑IL-1β和PGE-2炎症因子的表达量,其抗炎功效强于同等浓度下的甘草酸二钾。


2)使用含0.5%VGP的洗发水4周后,脂溢性头皮患者的油脂含量、TEWL值显著降低,头皮炎症包括红肿、头屑、瘙痒评分也显著缓解。


3)作为一种新型的植物复配组合物,VGP具有良好的抗炎止痒功效,可应用于头皮护理及护肤类产品中,缓解各类刺激对皮肤造成的损伤。


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