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上游技术 | 双特异抗体易聚集,连续化工艺解难题

来源:佰傲谷     发布时间:2021-10-15
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在基于动物细胞培养工艺的治疗性双特异性抗体(Bispecific antibodies,BisAbs)生产中,最主要的挑战是产物蛋白易聚集。由于聚集体会影响BisAb的功能活性、改变其药学性质,加快其在体内的清除速率或诱导不良的免疫反应,因此在工艺开发中需要尽可能减少或去除聚集体。

据此,本文首先介绍了BisAb聚集的一般形成途径,然后分析了灌流对BisAb聚集的缓解作用及其胞内机制。通过比较流加培养与灌流培养工艺的整体表现可知,在流加培养模式下,线粒体功能障碍会诱导谷胱甘肽氧化和内质网应激,进而破坏胞内氧化还原稳态,故易导致蛋白产物聚集。相反,采用灌流模式可缓解线粒体功能障碍和内质网应激,从而维持良好的胞内氧化还原环境,最终有效缓解聚集问题。

知识要点


1、BisAb聚集体的一般形成途径
(1)BisAb分子不稳定性相关的聚集途径
(2)细胞分泌途径相关的BisAb聚集途径

2、灌流工艺对BisAb聚集的缓解作用
(1)灌流工艺的特征和优势
(2)灌流工艺对BisAb聚集的缓解作用
(2)灌流工艺影响BisAb聚集的胞内机制

主要论述

BisAb是一类单克隆抗体(Monoclonal antibodies,mAbs),其可识别两种不同的抗原,故能同时靶向多种途径。但是,其所含工程化的二硫键容易发生错配,进而诱发蛋白聚集,因此有可能使产量降低。蛋白聚集的形成途径有很多种,包括:BisAb分子自身的化学和物理不稳定性所导致的聚集;BisAb分子的特殊性和复杂性所致胞内表达与分泌之间矛盾所致聚集等。


由于聚集体可诱发患者体内发生不良的免疫原性反应,因此必须减少或清除。虽然产品聚集体大多是在胞内形成的,但传统的缓解聚集的工艺开发策略往往偏重于pH、温度、DO等胞外参数,而鲜有研究这些因素对胞内环境的影响。与流加培养模式相比,灌流培养模式可以为细胞培养基产物表达创造更为稳定的环境(如:氧化还原态、ER Stress、酶活性等),而且可以缩短产物在生物反应器中的存留时间,从而减少产物与可能诱发不稳定性可导致蛋白聚集的因素之间的接触时间,因此能大幅降低聚集体比例。

BisAb聚集体的一般形成途径

BisAb易形成聚集体
BisAb能与一种以上的抗原结合,因此其分子结构一般较为复杂,其通常包括单链可变片段、连接物和介导非对称多肽链正确配对工程化残基(图1)。一般来说,异二聚体和多链双特异性IgG具有两个不同的轻链和两个不同的重链,它们必须通过多种工程化的链间相互作用进行正确配对(例如:正交Fab界面(Orthogonal interface)、域交叉(Domain crossover)、电荷突变(Charged mutations)、空间互补突变(Sterically complementary mutations)等)才能正常折叠。
BisAb中这些修饰结构可导致细胞培养中出现一些产品相关的新杂质,包括:聚集体等高分子量异质体、片段等低分子量异质体、蛋白质结构域构象错误而暴露的残基等。BisAb结构域的热力学稳定性通常较低,因此更容易聚集,在传统流加培养和强化型流加培养中聚集体比例可能高达60%以上。尤其一些复杂的生物制剂,在细胞培养中更可能出现不对称分子与半抗或同型二聚体发生不正确配对,最终形成蛋白聚集体。

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图 1 双抗结构示意图

BisAb分子不稳定性相关的聚集途径

抗体分子聚集大多是由于分子自身的物理和化学不稳定性所致,聚集的途径多种多样。其中化学因素较为复杂,主要受胞内外环境的氧化还原状态影响,此处不予赘述。物理不稳定性所导致的聚集形成途径主要有以下三种(图 2):

1、由于蛋白的热力学和/或动力学折叠稳定性低,高温等应力可导致一个或多个抗体结构域解折叠而展开。如果抗体的未折叠构象能够聚集(非天然胶体稳定性低),则抗体的这种未折叠状态可导致聚集。然而,未折叠抗体也可在不聚集的情况下重新折叠(高度非天然胶体稳定性)。

2、高浓度或低温等应力可导致抗体聚集,而不会对天然胶体稳定性低(即天然溶解度低)的抗体解折叠。

3、最后,如果互补抗体结构域之间的界面不稳定,抗体也可在不解折叠的前提下通过结构域交换而发生聚集。

据此,抗体聚集过程即折叠或未折叠抗体凝聚成可逆或不可逆的聚集体的过程。具体而言,如果抗体的热力学或动力学折叠稳定性较低,则高温或低pH值等应力可导致抗体部分或完全展开。在多域抗体中,有可能仅仅其中一个或部分结构域展开。对于部分或完全展开的抗体而言,其聚集倾向由分子内相互作用控制的复性过程和由分子间相互作用控制的聚集过程之间的竞争关系决定。其中,抗体在展开状态下的聚集倾向称为非天然胶体稳定性。如果未折叠抗体之间的分子间相互作用具有足够的吸引力(低胶体稳定性),则未折叠抗体可能会浓缩成非天然聚集体。相反,如果未折叠抗体之间的分子间相互作用是排斥力或较弱的吸引力(高胶体稳定性),则未折叠抗体能够发生可逆折叠而不聚集。

此外,抗体也可以通过无需解折叠的机制发生聚集。例如:抗体浓度升高、低温和相关压力可导致具有低天然胶体稳定性的抗体在具有吸引力的抗体自身相互作用下浓缩成天然聚集体。多结构域抗体可以与来自其它相同分子的互补结构域进行结构域交换,形成每个单独结构域折叠的聚集体。
一般而言,抗体聚集体是由上述一种以上原因所致,所以聚集过程通常较为复杂。

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图 2 物理不稳定性相关的抗体聚集途径


细胞分泌效率相关的BisAb聚集途径

除上述因素以外,由于BisAb的固有非自然性及其分子复杂性,通常使其难以在细胞中高效表达,故单细胞比产率一般较低,基因扩增效率也很有限。因此,在细胞株开发过程中可能需要独特的载体设计和多轮克隆筛选,以确保BisAb多条链之间的表达速率平衡,并且保证表达速率与翻译后修饰速率匹配,防止错配而发生聚集。由于BisAb转录和/或翻译水平很高,会使得胞内未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)和内质网相关蛋白降解(ER associated protein degradation,ERAD)等质量控制机制不堪重负(图 3)。此外,与内源性蛋白质相比,BisAb是大分子蛋白,本质上更难正确折叠。因此,新生多肽链向内质网移位的效率低下、信号肽的错误切割、导致降解和/或细胞内聚集的错误/不完整折叠、内质网应激及其诱导的凋亡、低效囊泡转运等胞内反应途径均可能是分泌过程中的潜在瓶颈,故目的蛋白易于发生聚集。反之,当表达易聚集蛋白结构时,也可能会导致内质网过载和分泌途径受阻,从而使细胞状态变差,生长受到抑制,产率下降。


由于聚集体会影响BisAb的功能活性,改变其毒理或药理学相关性质,加快其在人体内的清除速率或诱导对人体不利的免疫反应,因此在工艺开发中需要尽可能减少或去除聚集体。


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图 3 胞内蛋白折叠和分泌途径


通过连续灌流细胞培养工艺降低BisAb聚集水平


灌流工艺的特征和优势

蛋白类生物药生产中最常用的培养模式是流加培养和灌流培养(图1),一般根据宿主细胞和目标产物的性质进行选择。在流加培养中,通过在不同时间点添加高浓度流加培养基来防止营养耗竭,以延长培养时间和提高产量。在灌流培养中,以恒定流速添加培养基,并以相同流速去除培养上清,且采用截留装置将细胞截留在反应器内。


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图 4 流加和灌流培养模式示意图 (A:流加;B:灌流)

与流加培养相比,灌流培养的整个生产阶段维持恒定的培养环境,反应器中所有过程的动力学特征不会随时间变化,包括与杂质或翻译后修饰相关的动力学特征。因此,灌流反应器中各个时间段所产产物的一致性较高,而不会导致似流加培养中一样的累积效应。不仅如此,采用灌流培养所产产品的异质性范围更窄,故可根据质量需求进行合理调控。

此外,间歇式的流加培养与连续式的灌流培养的另一个重要区别在于产物的停留时间。在流加培养过程中,产品从形成之时起一直保留在反应器中,直至操作结束。同时,营养物不断消耗,代谢废物和因细胞死亡而释放的细胞内容物不断累积,导致培养环境持续发生变化。因此,蛋白质受到许多翻译后修饰作用(Post-translational modifications,PTM)的影响,包括:氧化、脱酰胺、聚集和其它可能导致异质体的形成过程。在灌流培养中产物在反应器中的停留时间会短很多,因此蛋白聚集体和上述其它异质体会明显减少。而且,由于细胞死亡较少,整个过程封闭,所以与工艺相关的杂质(如DNA、HCP、原料相关杂质或污染物)也更少。因此,在流加培养中大多数杂质会不断累积,必须通过下游纯化工艺加以清除。相反,灌流系统的连续培养液交换系统可防止此类杂质的产生和累积。因此,灌流培养工艺常用于生产酶、血液因子、BisAb等不稳定或易降解的分子。


综上所述,灌流细胞培养可用于减轻或减少一些与产品相关的杂质,其能有效缩短产品在生物反应器内的停留时间,并防止产品积累和浓度增加,从而可最大限度地减少BisAb的物理或化学降解,因此可以避免前述各种物理、化学和生物相关的蛋白聚集体形成途径。此外,通过高细胞密度灌流培养工艺还能改善细胞生长、活率和体积生产率,有利于提高工艺的经济性。


灌流工艺可以有效减少BisAb聚集体


基于上述分析,有望通过连续的灌流培养工艺降低BisAb的聚集水平。因此,以下简单介绍运用灌流工艺减少BisAb聚集体的案例。


Amgen公司的Gomez等研究者在2019年的一项研究中发现,CHO细胞流加培养工艺所产重组双特异性支架蛋白X(Protein X)中聚集体的比例高达62%(图1)。在工艺优化过程中观察到,对流加培养工艺进行优化后可使活细胞密度增加2倍,但qp降低,故最终产量(Titer)并未得到相应的增加。据此推测,蛋白质聚集可能与Titer增加相关。为了防止这种现象,研究者评估了灌流细胞培养工艺,其目的为使生物反应器内保持较低的蛋白质浓度,以防止蛋白发生聚集。因此,采用灌注工艺研究了不同目标VCD对Protein X浓度、产量和聚集体形成的影响。


结果表明,在所有不同的VCD条件下,qp保持不变。相较于流加培养工艺,灌流工艺中Protein X单体产量提高了4-5倍,且单体含量从平均44%提高至70%,聚集体含量降低至30%左右(表 1)。总体而言,单位体积的蛋白产率大幅提高,推测原因可能为:一方面,灌流培养中细胞的整体状态较佳,故其能够始终维持较高的qp水平;另一方面,在灌流培养中,生物反应器中蛋白被连续置换,反应器内蛋白的累积浓度较低,所以聚集体大幅减少。
微信图片_20211015131935.png图 5 流加培养工艺中双特异性蛋白Protein X聚集体比例高达60%以上

微信图片_20211015131941.png表 1 灌流培养工艺大幅降低Protein X的聚集体比例


该团队在次年(2020年)进一步考察了灌流工艺对6种细胞株和3种双特异性重组支架蛋白的影响。分别采用约12天的流加工艺和约40天的灌流工艺进行细胞培养和产物表达,以比较两种工艺条件下所产蛋白的产量和质量属性。结果表明,与流加工艺相比,强化灌流工艺过程平均IVCD和总产量增加约15倍,单日单位体积产率提高约5倍,而且聚集体最多减少72%(表 2)。总体而言,强化灌注工艺可大幅提高治疗性蛋白的产率,有效改善产物的质量属性,在BisAb的生产工艺开发中展现出了巨大的潜力。

微信图片_20211015131946.png表 2 综合比较流加和灌流工艺


微信图片_20211015131951.png表 3 比较流加和灌流工艺所产蛋白的聚集水平

灌流工艺降低BisAb聚集水平的胞内机制

为了系统性地理解影响BisAbs等治疗性蛋白聚集的胞内机制和调控因素,并深入分析灌流培养工艺降低BisAb聚集水平的胞内机理,Sinharoy等研究者于2020年全面比较了流加培养和灌流培养工艺的表现,深入研究了细胞比生产率和胞内氧化还原状态之间的协同关系对胞内产物聚集体形成过程的调节作用。


本研究采用表达相同BisAb分子的同一CHO克隆分别进行流加和灌流培养,以考察培养模式对细胞整体表现的影响。结果表明,与流加相比,灌流工艺可有效提高细胞密度(Viable cell density,VCD和细胞活率(Viability,VIA),进而大幅提高BisAb的总产量。初步分析BisAb聚集水平可知,与前述Gomez等研究者的结果一致,灌流工艺可以有效缓解BisAb聚集。并且,采用非还原和还原毛细管蛋白免疫印迹法分析证明,灌流工艺主要是减少了二硫键错配所致的聚集体。


进一步分析胞内氧化还原状态可知,相较于灌流培养,流加培养中(Reactive oxygen species,ROS)水平升高而导致细胞受到氧化损伤,使得BisAb蛋白更易聚集。相反,灌流培养可有效缓解胞内的氧化应激反应,从而保护细胞免受氧化损伤,最终得以降低BisAb聚集水平。


通过检测ROS相关的超氧阴离子(O2−·)、基础耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR)、线粒体内膜和/或呼吸链复合体(Electron transport chain,ETC)的电子泄露、线粒体膜电位(Δψm)和胞内氧化应激反应超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SODs)可知,灌流工艺可减轻ETC功能障碍,进而降低细胞对ATP的需求量,并减少与之相关的超氧化物的生成,最终有效延长了线粒体的寿命。此外,超氧化物减少后,线粒体中ROS的生成量也更少,从而可有效缓解BisAb聚集问题。


一般而言,胞内氧化还原状态在很大程度上受胞内谷胱甘肽水平的调节,故本研究利用光学分析法评估了胞内GSH与GSSG的比率。结果显示,灌流培养可提高胞内的GSH/GSSG比率,并维持良好的胞内氧化还原稳态。


氧化应激会导致蛋白质折叠速率过载,进而触发内质网(Endoplasmic reticulum,ER)应激(ER Stress),最终诱导激活复杂的未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)信号网络。因此,本研究采用蛋白免疫印迹法分析了ATF-6、CHOP和BiP蛋白表达水平。结果表明,灌流培养可诱导对细胞有利的UPR反应,且能缓解UPR介导的细胞凋亡,进而改善ER内稳态。


综上所述,培养过程中细胞内外环境的变化作用于线粒体功能完整性、氧化还原稳态和ER Stress,最终影响产物聚集体的形成(图 5)。若采用灌流培养替代流加培养模式,则能为细胞生长和维持提供更有利的胞内外环境,从而延缓线粒体功能衰退、维持胞内氧化还原平衡和缓解ER Stress,最终有效降低BisAb聚集水平。


微信图片_20211015131955.png图 6 BisAb聚集的胞内机制示意图


编结语


相比传统的单克隆抗体,双特异性抗体BisAb的分子的结构比较复杂,形式多样,而且分子结构特殊,易于受到各种物理、化学和胞内生物压力因素的影响而产生聚集体。为了有效提高上游工艺产率、下游纯化收率、产品质量及临床效果,有必要全面深入地了解bsAb聚集体形成的机理。在BisAb的生产中,蛋白聚集是比较常见的问题,是BisAb大规模商业化生产中一大挑战。关于蛋白聚集发生机制的研究有很多,但对于BisAb聚集发生机制的系统性研究尚有限。


因此,本文首先介绍了几种可能的bsAb聚集体形成途径,然后比较了流加培养和灌流培养工艺模式对bsAb聚集的影响,旨在据此深入分析灌流培养对bsAb聚集缓解作用的深层机理。结果表明,胞内的线粒体功能、氧化还原状态和ER Stress对bsAb聚集的形成具有重要影响作用。相比流加培养模式,灌流培养主要通过增强线粒体功能、维持胞内氧化还原态平衡和缓解ER Stress而降低有效降低bsAb聚集水平。简言之,培养过程中细胞内外环境的变化作用于线粒体功能完整性、氧化还原稳态和ER Stress,最终影响产物聚集体的形成。不过,从以往研究结果来看,灌流培养操作较为复杂,且对bsAb聚集水平的作用程度比较有限,还需要持续不断地进行深入研究和技术迭代。本文结果可用于指导基于细胞内氧化还原状态的细胞工程化改造和克隆筛选过程,进一步提高细胞整体的产率,并减少聚集。


随着细胞株开发技术的不断进步,现已能根据促进蛋白质聚集和折叠的各种作用力设计抗聚集的蛋白分子,进而有效减少聚集体。但是,仍需要在减少聚集和保持正确的折叠和特异性结合力之间加以合理取舍。在设计聚集抗性突变时,应仔细考虑诱发免疫原性的风险。现已经可基于蛋白分子结构和热稳定性进行计算机建模,预测分子的聚集倾向/易聚集区域(Aggreagation regions,APRs),从而能有针对性地进行分子设计。不过,尽管可通过计算机建模手段预测抗体序列中的APR,但由于细胞培养及后续产品的处理过程较为复杂,影响因素众多,所以很难通过计算机模型预测和解释抗体的聚集机理。


微信图片_20211015132001.png图 7 设计抗聚集的蛋白分子

与细胞系工程和细胞培养条件优化等上游加工领域的实质性发展相比,bsAbs的新型下游纯化方法的开发报道较少。如前所述,bsAb形式多样,且在生产过程中易于形成大量bsAb所特有的副产物,因此较难在有限的纯化步骤内开发可获得高纯度和产率的产品的高效下游工艺。深入研究可溶性聚集中间体、聚集动力学及其机理、bsAb分子间作用力及其与溶液条件的相互作用,可以有效指导后续的纯化工艺和制剂配方的优化,从而加速bsAb治疗学的发展。


微信图片_20211015132009.png图 8 bsAb聚集体的下游纯化策略


根据质量源于设计(Quality by design,QbD)理念和cGMP要求,可采用系统化的开发方法建立健全科学的质量风险管理和过程控制体系。然而,bsAb等生物技术产品的生产过程是复杂的多步骤过程,在各个阶段都可能会产生聚集体。因此,需要加深对聚集相关工艺条件的理解,更合理地设计单个工艺步骤,并且对各个步骤构建多维设计空间,并且根据工艺条件及其对质量的影响作用对设计空间不断进行修正。

因此,在工艺开发中可以采用各种先进的离线和在线检测技术密切监测胞内氧化还原状态和胞外环境参数,并据此有效改善细胞状态、培养环境、下游缓冲液、制剂配方及样品的处置操作,减少产物聚集体的形成。此外,可进一步探究聚集的形成机理,为抗体-化学小分子偶联药、单抗-肽偶联药、融合蛋白等其它含二硫键的治疗性蛋白工艺开发提供充分的数据和理论支持。


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