生物药蛋白的表征&异构体分析

细胞系的构建是一个重要而复杂的步骤，获得单克隆的细胞株后，需要进一步对这些细胞产生的蛋白进行验证以及表征，以期获得正确的产物。

蛋白具有分子量相对较大、结构复杂、高度非均一性等特点，因此对其的表征极具挑战，它需要广泛的技术专长和解析方案。丹纳赫生命科学具有一系列的蛋白表征分析方案，可对蛋白的结构、理化、功能等方面进行广泛而深入的解析。

蛋白结构的表征
蛋白质是由不同氨基酸连接形成的多聚体，并且通过正确折叠为一个特定构型，发挥蛋白药物的生物学功能。氨基酸序列的特定位置可以与化学基团共价结合，发生蛋白质翻译后修饰，这些翻译后修饰会导致蛋白的结构发生改变，从而影响蛋白药物的生物学活性，所以需要对蛋白的分子量、肽段覆盖率、翻译后修饰等进行检测。

高分辨质谱目前是进行蛋白结构表征的最广泛，也是最重要的工具。丹纳赫生命科学拥有高分辨质谱，结合成熟的前处理流程和强大分析功能的软件，可以完成蛋白的各种结构表征。

1.分子量的检测

分子量的检测是鉴定蛋白的第一步，使用高分辨率质谱分析可得到蛋白质的多电荷信号，通过对信号进行去卷积分析，可获得精确分子量数值，并初步判断蛋白的修饰状态。对于抗体药物还可打开轻重链或者去除糖基，分别分析糖基化和去糖基化轻链和重链的分子量。

 2. 肽段覆盖率及翻译后修饰分析

肽段覆盖率是指检测到的肽段氨基酸数量占该蛋白质总氨基酸数量的比例。蛋白质肽段覆盖率的检测，对于蛋白质类药物的一级氨基酸序列的确证，保证蛋白质类药物的高级结构形成及维持蛋白质类药物性质均具有很重要的意义。

将样品通过酶切，进入质谱采集肽段的一级质谱信息和二级碎片离子质谱信息。采用软件对总离子流图进行分析，将测得肽段的相对分子量与理论值进行比较，并且通过二级质谱离子确认多肽的序列正确性。根据已确认肽段的氨基酸序列与理论序列的比值计算肽图覆盖率。
通过丰富的碎片离子信息，可以识别翻译后修饰发生的位点。

3. 二硫键分析

二硫键是蛋白质通过各种链间和链内的半胱氨酸连接在一起的化学键，对蛋白质分子保持正确的高级结构，维持必要的生物活性至关重要。所以在蛋白质类药物的结构分析中，二硫键一直是分析的重点。
通过相关软件不仅可以确认理论连接二硫键，还能检索错配二硫键，最终结果能同时呈现以上两种二硫键连接肽段。

4. N-糖糖型分析

N糖（聚糖与天冬酰胺的氮链相连）是生物药物中，尤其是单抗药物中最广为人知的糖基化形式，其中N-聚糖结构会影响药代动力学、药效学和免疫原性，因此需要对糖型进行分析。丹纳赫生命科学可向用户提供两种解决方案对N糖糖型进行分析。一种是利用糖苷酶将糖链切下，经过荧光素 2-AB（对氨基苯甲酰胺）标记后，采用旗下SCIEX的高分辨质谱进行检测，通过软件中的CHO表达体系中常见的236种N糖糖型，对样品中的糖型进行解析。由于重组蛋白中的N糖糖型比较复杂，匹配全面的数据库，适合用质谱进行解析。

另外，丹纳赫生命科学还有毛细管电泳方法快速对N糖糖型进行分离分析。采用磁珠结合样本，用糖苷酶将糖链切下，用APTS进行标记，样品洗脱下来后进入毛细管电泳进行分离检测，软件内置糖型数据库，可对结果进行快速分析，整个过程只需65分钟，前处理1个小时，分离分析5分钟，方便快捷。

使用SCIEX毛细管电泳进行快速糖型分析，还可搭配自动化高通量前处理的方案，可以跟Beckman Coulter的自动化工作站进行整合，同时进行96个样本的糖型检测前处理，结果稳定，重复性好，主要糖型峰面积的RSD小于3%。毛细管电泳的方法适合进行单抗N-糖的糖型分析。

5. 蛋白深度表征方案

除了常规的蛋白结构表征方案外，丹纳赫生命科学还可提供更加深入的蛋白表征分析，如O-糖糖型分析，高分辨质谱利用电子活化解离（EAD）模式，鉴定氨基酸同分异构体，岩藻糖基化N-糖的定位和确认等。

总结

蛋白药物的结构与蛋白生物学功能息息相关，采用合适的方法对其表征进行检测对药物研发具有重要意义，丹纳赫生命科学能够从质到量提供多方位的蛋白结构表征解决方案。

生物药蛋白的异构体分析

如上所说，蛋白类药物具有的翻译后修饰，如糖基化、N末端的焦谷氨酸化、C末端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等，这些不同的翻译后修饰组合可使蛋白分子产生无数种电荷异构体。另外，单抗在特定的条件下会发生降解、断裂，形成低分子量的片段。这些异构体对于蛋白药物的稳定性及生物学功能发挥具有重要影响，需要用合适的方法进行分析。
丹纳赫生命科学拥有用毛细管电泳法（CE）检测单抗的纯度及蛋白电荷异构体的解决方案。

1.CE-SDS进行单抗纯度及大小变异体的检测。
CE-SDS蛋白凝胶电泳是采用液态凝胶作为筛分介质，根据不同分子量大小的样品在凝胶中不同的迁移时间将其区分，从而进行大小变异体检测。

将单抗与 β-巯基乙醇或碘乙酰胺混匀进行前处理后，进行还原及非还原的纯度分析。该方法有两种分析分离的模式，分别为高分辨率（High Resolution, HR）和快速（High Speed, HS）模式。HR下样品从进口端到检测窗口的距离为20.0 cm。HS下样品从进口端到检测窗口的距离为10.2 cm。HS模式的分辨率略有下降，但是相比HR模式能够带来更快速的分析（HS大约需要15 min，HR大约需要30 min）。

通过还原处理，可得到单抗的轻链、非糖基化重链以及重链，其中非糖基化重链和重链能够达到基线分离。在非还原法中，得到了轻链、重链、二重一轻链、非糖基化的IgG以及IgG主体。

另外，还可以用激光诱导荧光 (LIF)的检测方式，对单抗分子大小异构体进行高灵敏的检测，灵敏度可比UV高10倍。

2. 等电点及电荷异构体的检测
毛细管电泳仪可以采用等电聚焦电泳（Capillary Isoelectric Focusing, cIEF）及区带电泳（Capillary zone electrophoresis CZE）两种方式对蛋白电荷异构体进行表征。

在cIEF的分离过程中，毛细管左右两端施加的高压电场使得阳极液和阴极液中的氢离子和氢氧根离子相向运动，其内部填充的两性电解质在酸性（阳极）溶液和碱性（阴极）溶液所形成电场的作用下形成连续的pH梯度，从而使得两性化合物向各自等电点（pI）迁移，可以得到不同电荷异构体的峰。
采用同一种分离方法，CE能够在宽pH范围内对多种单抗进行cIEF分析。此种方法使用三种PI marker，等电点计算值更加准确；分离使用30cm长的毛细管，能够获得较高的分辨率。

cIEF是一种根据蛋白各亚型等电点的变化分离电荷异构体的方法，需要在涂层毛细管中进行聚焦和迁移，分辨率高，但是分析时间较长，因此还可以采用区带电泳CZE的模式快速对蛋白电荷异构体进行分析。可使用EACA作为两性电解质，TETA作为动态涂层，HPMC作为筛分基质对蛋白的电荷异构体进行分离，只需12分钟就可得到高分辨率和高重现性的分离结果。

PA 800 Plus 毛细管电泳制药分析系统配有UV、PDA、LIF三种检测器，配合IgG纯度分析试剂盒，cIEF 等点聚焦试剂盒和CZE试剂盒可进行单抗纯度、蛋白等电点及电荷异构体分析，另外PA 800 Plus具有专利的循环冷却控温系统可使结果的重复性和稳定性更佳。

来源：荣格-《国际医药商情》



原创声明：
本站所有原创内容未经允许，禁止任何网站、微信公众号等平台等机构转载、摘抄，否则荣格工业传媒保留追责权利。任何此前未经允许，已经转载本站原创文章的平台，请立即删除相关文章。