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第8集人类的希望:mRNA疫苗技术对于化妆品科技创新的启示

来源:国际个人护理品生产商情 发布时间:2022-05-09 1352
食品饮料及个护个人护理品原料配料加工生产设备包装设备及材料其他 技术前沿
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改变世界的三把钥匙:前沿科学研究进展报告

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基础研究往往是需要披荆斩棘的而非乘风破浪的,因为科学家包括他们自己也无法预测出这种技术在未来的什么时候才能派上用场。但科学的奇迹往往在那些不经意的细节中被发现。mRNA疫苗技术,最早的应用方向是艾滋病疫苗研究。在SARS和MERS等冠状病毒疫情爆发后,其应用方向被逐渐转移到冠状病毒研究中。

2020年初,新冠病毒导致的肺炎疫情开始在全球大流行,并一直延续至今。遗憾的是,直到今天,新冠疫情的形势仍然非常严峻。据世界卫生组织(WHO)报告,截至目前全世界范围内超过5亿人被感染,累计死亡人数超过610万。延续三年的新冠疫情,不仅让mRNA疫苗技术迎来了科学的新时代的契机,并且拯救了无数人类的生命。让曾经非常冷门的mRNA疫苗技术,被大众所熟知。

一、mRNA疫苗是什么,有何独特之处?

mRNA(Messenger RNA),即信使RNA,是携带编码蛋白遗传信息的单链RNA,是由DNA的一条链作为模板转录得来的,能够携带遗传信息,并且能指导蛋白质合成的一类单链RNA。通俗来讲,在细胞内,mRNA指导把单个氨基酸按特定序列组成蛋白质,是细胞内“蛋白工厂”生产的“作业指导书”。mRNA复制了细胞核中双链DNA的一条链的遗传信息,随即离开细胞核在细胞质中生成蛋白质。在细胞质中,核糖体沿着mRNA移动,读取其碱基序列,并翻译成其相应的氨基酸,最终形成蛋白质。

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mRNA疫苗在人体细胞内的免疫反应形成过程


mRNA疫苗是将带有疾病特异性抗原的mRNA引入体内机体细胞,利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原,从而触发免疫应答。通常可根据不同疾病构建特异性抗原的mRNA序列,由新型脂质纳米载体颗粒(LNP)包裹运送至细胞内,再利用人体核糖体翻译mRNA序列产生疾病的抗原蛋白,刺激机体产生特异性免疫学反应,从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。

新冠疫情的爆发,使mRNA疫苗技术受到极大的关注。迄今为止,全球mRNA技术47%应用于传染病领域,30%应用于肿瘤治疗领域,17%应用于蛋白质替代以及基因治疗。

那么,与传统疫苗相比,这类mRNA疫苗又有什么独特之处呢?

第一代传统疫苗主要包括灭活疫苗和减毒活疫苗,使用最为广泛。灭活疫苗是指先对病毒或细菌进行培养,然后用加热或化学剂将其灭活;减毒活疫苗是指病原体经过各种处理后,发生变异,毒性减弱,但仍保留其免疫原性。灭活疫苗接种到人体内之后,不会引起疾病的发生,但病原体可在机体内生长繁殖,引发机体免疫反应,起到获得长期或终生保护的作用。

第二代新型疫苗包括亚单位疫苗和重组蛋白疫苗。亚单位疫苗是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗亚单位疫苗,即通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法,提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构,筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗;重组蛋白疫苗是在不同细胞表达体系中产生的抗原重组蛋白。

第三代前沿疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。是将编码某种抗原蛋白的病毒基因片段(DNA 或RNA ) 直接导入动物体细胞内(疫苗注射到人体),并通过宿主细胞的蛋白质合成系统产生抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,以达到预防和治疗疾病的目的。两者的区别在于DNA是先转录成mRNA再合成蛋白质,mRNA则直接合成。


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mRNA疫苗的编码过程示意图


mRNA疫苗是将外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送保护系统导入机体细胞,通过在体内表达目的蛋白,刺激机体产生特异性免疫学反应,从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂。例如新冠病毒mRNA疫苗,是将被纳米脂质体包裹的新冠病毒的外壳(刺突糖蛋白)的编码mRNA,直接注射进入人体内,能够在人体内合成刺突糖蛋白,并通过它来模拟病毒感染来刺激训练人体免疫系统,产生抗体和记忆细胞。

mRNA的制备通常包括以DNA为转录模板进行mRNA体外转录、mRNA加帽、去磷酸化、DNA酶处理、mRNA纯化等步骤。其中加帽可在转录过程中进行,也可作为单独的步骤在转录后进行;mRNA核苷酸修饰、加Poly(A)尾通常在转录过程中进行。


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mRNA疫苗的生产工艺过程


假如从1961年发现mRNA算起,人类花费了约六十年时间才终于将mRNA应用于临床,这主要是因为mRNA是带负电荷的长链大分子,与同带负电荷的细胞膜因静电排斥难以进入人体细胞;并且mRNA分子是单链,本身极为不稳定,很容易被酶降解,难以稳定地被递送进入人体细胞内编码蛋白。因为裸露的mRNA分子无法安全抵达人体细胞内编码区,酶降解和膜屏障等重重阻碍,使得mRNA疫苗技术的发展徘徊不前。mRNA 疫苗研发来之不易的技术突破背后,是数百位科学家近20年来默默耕耘和通力合作的丰硕果实。

二、mRNA疫苗的封装制剂技术

将mRNA疫苗精准递送进入人体的幕后英雄,甚至可以说是整个mRNA疫苗免疫机理的关键所在,是将mRNA稳固封装并且安全有效地送进机体细胞的脂质纳米粒(Lipid Nanoparticle,LNP)。

mRNA分子非常不稳定,很容易被酶降解,所以在全身给药时需要保护其不受胞外血清中的RNA水解酶(RNAse)影响,从而保证mRNA可以顺利到达靶细胞。这就需要在递送mRNA时要将其包裹在密封载体内而避免被酶水解。


使用脂质体(liposome)递送mRNA的研发活动可以追溯到1970年代。早在1978年,研究人员就在体外实验中证明,使用脂质体可以将mRNA递送到细胞中。脂质分子是一种同时具有亲水性和亲脂性的两亲分子,它包含着一个极性头部基团和一个疏水的“长尾巴”。这一特征能够帮助携带负电荷的mRNA分子穿越细胞膜。

脂质及其衍生物凭借其低免疫原性、生物相容性及对mRNA较高的包封率成为近年来备受关注的mRNA疫苗的新型递送系统。基于脂质载体的递送系统能够包裹mRNA分子,包封率较高,保护mRNA免受酶降解。另外脂质载体通常会含有对mRNA细胞内转运有利的重要的功能性脂质成分。


这些脂质成分在生理环境下带有正电荷,通过静电作用将带有负电荷的mRNA分子包裹起来,并帮助整个载体系统与靶细胞的细胞膜相结合,从而起到递送mRNA的作用。

从原理上来讲,核酸药物的研发主要有三个壁垒:第一个是原料端,包括mRNA原料序列的筛选和修饰;第二个是递送系统;第三个是整个药物的生产工艺控制过程。目前采用微流控技术产生脂质纳米颗粒(LNP), 将mRNA包裹在LNP 纳米颗粒中,再进入人体, 是FDA唯一批准上市的mRNA传递技术,并且已经在世界各地注射上亿剂的mRNA新冠疫苗中采用,其技术的安全性和有效性已经在本次全球的新冠疫情中得到验证。

脂质纳米颗粒(LNP)是现阶段mRNA疫苗采用的主要递送体系,其直径100纳米左右,其化学成分主要包括中性脂质、阳离子脂质、胆固醇、PEG-脂质。可以有效负载mRNA分子,保护mRNA分子免受酶促降解,提高mRNA分子的内化效率。


LNP的结构及LNP递送mRNA的过程示意图


LNP由一种或多种特殊分子形成,这类分子是具有三个部分的两亲性分子,包括一个极性亲水头端和一个亲油尾端以及在两者之间的链接区域。在水溶液中这些两亲性分子可以和mRNA以及其他添加材料通过自组装形成稳定的球状纳米结构,其微观结构通常包括两种:一种是核酸存在于纳米球内部形成的反向脂质体胶束中(A),另一种是核酸嵌入脂质体双层结构之中(B).


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mRNA疫苗的微流控生产工艺过程


目前工业放大工艺多数采用微流控混合技术来制备LNP,通过将脂质与核酸分别溶解在水相和有机相后,将两相溶液注入制备系统的两条入口通道,一端是RNA的水溶液,一端是脂质的乙醇溶液,通过两相的快速混合,通过稀释乙醇相,脂质的溶解度降低,在混合溶液中逐渐析出凝固并形成脂质纳米粒,同时高效包载mRNA。再经过缓冲液膜包超滤或者透析除去残留的乙醇溶剂,中和缓冲液的pH值。通过改变流体注入速度和比率,可以控制脂质纳米颗粒的粒径分布。该方法相对简便快速,条件温和,同时容易实现生产放大。


三、mRNA疫苗的工艺控制技术

mRNA疫苗的安全性一直是研究人员所关注的重点。一方面体外引入的mRNA疫苗有可能引起干扰素反应,从而引起炎症,甚至会影响自身的免疫系统;另一方面,对于mRNA疫苗载体潜在的毒性,也会导致疫苗安全性问题。所以,在mRNA疫苗开展大规模的临床研究之前,一定要进行严格的安全性评价和严格的生产工艺控制和分析检验的验证,以及零下20度的冷藏运输与储存条件保证,才能被安全地注射使用。

对于mRNA疫苗的工艺控制指标的检验和控制,主要包括mRNA原液控制和LNP控制。mRNA原液的质控项目包括mRNA含量、纯度、产品相关杂质(如不完整mRNA、双链RNA等)、工艺相关杂质(如微球残留、蛋白酶残留、DNA模板、有机溶剂、金属离子)等。还包括mRNA的核酸序列正确性、加帽率等结构相关的质控项目。对LNP的质控重点项目有:复合率和/或包封率、pH、平均粒径及粒径分布、粒子微观形态、Zeta电位、渗漏/释放的评价等。

RNA含量一般用紫外分光光度法进行检测,序列正确性可通过Sanger测序进行确认。加帽率以及修饰核苷酸检测一般采用质谱法,是mRNA质控的重点和难点。高分辨的质谱核酸分析平台技术,可以实现mRNA加帽效率、ployA尾分析、mRNA mapping、杂质鉴定及定量等功能,为疫苗开发和质控提供更精确可靠的数据。

LNP的粒径分布以及Zeta电位可通过配套的粒度分析仪进行检测。核酸浓度、mRNA包封率项目可以通过荧光分析法进行检测。冷冻电镜可以在不破坏纳米粒子的结构前提下对LNP的形态进行观察,是常用一种对LNP形貌进行表征的手段。高效液相色谱法是一种有效质量控制的手段,可对LNP各组分如胆固醇、PEG的鉴定和含量则用进行分析。

四、mRNA疫苗对于化妆品科技创新的启示

虽然mRNA的免疫原性和稳定性等安全问题依然令人担忧,但是随着其他RNA基因治疗药物获得批准,mRNA疫苗和基因治疗药物必将获得更方法的实践应用。也许短期内mRNA技术可能存在很多问题,但长期来看,这绝对是值得探索的。

美国化学学会曾经指出:人类的未来是属于合成生物学的。合成生物学与传统精细化工方法不同,材料合成的来源不再是不可再生的石油资源,而是可再生的生物资源;并且生产过程不单是有机化合反应,更多依靠基因编辑改造,通过工程细菌基础上的细胞工厂代谢产生目标物质。

通过基因编辑改造技术,我们已经实现了在体外合成透明质酸和胶原蛋白,并且已经被广泛应用于整形外科美容、皮肤医学美容和生活美容产品中。展望皮肤科学的未来,我们可以大胆预测,外源性的基因将极有可能被引入皮肤成纤维细胞、角质形成细胞甚至皮肤免疫细胞中,从而被用于纠正和补偿皮肤细胞的代谢缺陷和细胞核衰老,以达到治疗皮肤病和医学美容的目的。

另一方面,脂质类材料作为体内可降解、生物相容性好的仿生材料,在递送药物方面有着巨大潜力,展望未来,mRNA疫苗纳米脂质包裹技术和微流控工艺技术在靶向进入人体细胞方面的基础研究和临床应用方面的巨大突破,并将为皮肤科学的透皮给药途径提供更多解决方案。

在药妆品的制备和配方中采用了更多创新的透皮给药系统,例如脂质体(LP)、固体脂质纳米粒子(SLN)、类脂囊泡、金纳米粒子、纳米乳液 (NE) 和纳米球和微流控技术的精确工艺控制,也许能够进一步促进皮肤渗透,增强活性物质深入皮肤层的传递,甚至实现进入衰老的成纤维细胞,进一步激活胶原蛋白生物合成、维持角蛋白结构、紧致和提拉皮肤,同时优化黑色素细胞代谢过程,提亮改善肤色。

在化妆品配方安全性方面,通过LNP微流控工艺技术,将极有可能帮助我们优化配方生产的精准工艺控制和配方的稳定性与安全性,提升化妆品配方的生物相容性,从而降低化妆品皮肤病和化妆品致敏性的发生概率。   


来源:荣格-《国际个人护理品生产商情》

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